Giám mục Nguyễn Văn khôi sinh ngày 13 tháng 10 năm 1951 tại thôn Xuân Phương, xã Phước Sơn, huyện Tuy Phước, tỉnh Bình Định, thuộc Giáo xứ Gò Thị, Giáo phận Qui Nhơn.[3] Cha ông là ông Giuse Nguyễn Chánh và mẹ là bà Maria Nguyễn Thị Báu (1918 – 2008).[4] Gia đình ông có ba anh em: anh cả đã qua đời, rồi đến Giám mục Khôi và em út là ông Nguyễn Kim An (có con là Linh mục Nguyễn Kim Ngân).

Thấy cậu bé Khôi có chí hướng tu tập, năm 1963, gia đình đưa cậu nhập học Tiểu Chủng viện Làng Sông – Quy Nhơn và cậu đã tốt nghiệp tại đây năm 1970.[4] Sau đó, chủng sinh Khôi tiếp tục con đường tu trì bằng việc học Triết và Thần học tại Giáo hoàng Học viện Thánh Piô X, Đà Lạt, đến năm 1977 thì tốt nghiệp. Ngoài chương trình chủng viện, chủng sinh Khôi còn theo học Khoa Văn học tại Ðại học Công giáo Ðà Lạt.[3] Ngoài ra, trong hai năm 1974 và 1975, chủng sinh Khôi còn thực hiện các công việc tại Tiểu Chủng viện Qui Nhơn.[4]